Dalla terapia fotodinamica alla fotofarmacologia: le applicazioni mediche di una delle prime macchine molecolari


Rinaldo Cervellati

Ne parla diffusamente Katharine Sanderson in un articolo intervista su* Chemistry & Engineering newsletter del 2 aprile scorso, che vale certamente la pena di riportare integralmente.

Nella terapia fotodinamica, le cellule tumorali sono esposte alla luce laser, a volte tramite sonde a fibre ottiche. Un’impostazione simile potrebbe presto essere utilizzata in fotofarmacologia, oppure i medici potrebbero aver bisogno di impiantare LED per illuminare le aree bersaglio del corpo umano.

Terapia fotodinamica: le cellule tumorali sono esposte alla luce laser, a volte tramite sonde a fibre ottiche.

Nella lotta contro il cancro, le nostre opzioni terapeutiche sono migliorate nel corso degli anni. Ma sono ancora lontane dall’essere ottimali. Oggi i medici somministrano farmaci chemioterapici nella speranza di eliminare o ridurre un tumore prima che provochi troppi danni ad altre parti adiacenti del corpo del malato.

Ora i chimici sperano di guadagnare ancor più terreno in questa battaglia, progettando piccole molecole che possono essere attivate dalla luce all’interno dell’organismo dopo aver raggiunto il bersaglio, limitando così drasticamente gli effetti collaterali.

Gli scienziati mirano a utilizzare questi farmaci fotosensibili non solo per combattere il cancro, ma pensano anche che composti con un comportamento simile potrebbero essere utili nel trattamento della cecità e di altre gravi malattie. Antibiotici regolabili con segnali luminosi potrebbero persino aiutare a combattere la farmacoresistenza. Si deve pensare a questi farmaci come a interruttori molecolari, quando colpito dalla luce il farmaco si attiva, quando si spegne la luce il farmaco si disattiva. Mantenendo quindi la luce spenta quando il farmaco non lavora si impedirà ai patogeni di riconoscerlo come pericoloso e quindi di svilupparne resistenza.

Sebbene l’interesse per lo sviluppo di questi interruttori molecolari sia in aumento, la ricerca nel settore presenta ancora importanti problemi da risolvere. Ad esempio, i ricercatori devono assicurarsi che gli interruttori molecolari funzionino a lunghezze d’onda clinicamente inerti, per intenderci quelle che possono passare attraverso i tessuti senza fare danni. Inoltre i ricercatori devono poter lavorare in stretta collaborazione con i clinici per trovare dispositivi adatti a accendersi e spegnersi in prossimità di uno o più bersagli all’interno del corpo del malato.

L’idea di usare la luce per trattare alcune patologie non è completamente nuova. Ad esempio, la terapia fotodinamica (PDT) tratta i tumori e altre malattie della pelle. In questo tipo di terapia ai malati vengono somministrati farmaci colorati sotto forma di pillole, iniezioni sottocutanee o creme applicate sulla cute. La pelle così trattata viene illuminata con luce di opportuna lunghezza d’onda, che attiva le molecole del farmaco le quali convertono l’ossigeno dal suo stato normale di tripletto allo stato eccitato di singoletto, un potente radicale libero che distrugge le cellule malate.

Il fatto però che molti tumori sono ipossici, cioè richiedenti abbondante ossigeno, può ridurre molto l’efficacia di questo tipo di strategia.

Edith C. Glazer e il suo gruppo all’Università del Kentucky ha sviluppato complessi polipiridilici del rutenio (II) che espellono un ligando quando attivati dalla luce.

Effetto della luce su uno dei complessi di Glazer

Il composto residuo si lega poi al DNA delle cellule cancerose provocandone l’apoptosi.

Edith C. Glazer

A differenza delle molecole colorate nella PDT, le terapie fotofarmacologiche “utilizzano l’energia di un fotone per provocare un cambiamento chimico all’interno della struttura del farmaco”, spiega Glazer, “e questa nuova struttura si lega a un particolare bersaglio causando la morte delle cellule cancerose”.

In altre parole l’espulsione irreversibile di un ligando consente ai complessi di reticolare il DNA delle cellule cancerose provocandone danni irreparabili. Glazer può regolare la solubilità dei complessi e le lunghezze d’onda della luce che assorbono scegliendo opportuni ligandi, oppure creare composti a “doppia azione” che espellono i ligandi e sviluppano ossigeno singoletto (S.B. Howerton et al. Strained Ruthenium Complexes are Potent Light-Activated Anticancer Agents., J. Am. Chem. Soc. 2012, DOI: 10.1021/ja3009677).

Queste molecole possono essere davvero potenti, dice Glazer. “Le cellule si sono evolute per opporre resistenza all’ossigeno singoletto, poiché questo si forma naturalmente, ma addotti DNA-metallo non esistono in natura e quindi può essere più difficile per la cellula sviluppare una resistenza”.

Ma molti chimici, come Wiktor Szymanski dell’University Medical Center di Groningen, vogliono fare un ulteriore passo avanti e utilizzare la luce per “accendere” (attivare) e “spegnere” (disattivare) farmaci, facendoli diventare veri e propri interruttori. Recentemente si è concentrato su antibiotici fotocommutabili.

Viktor Szymansky

In questo modo il medico potrebbe decidere non solo quando ma anche dove gli antibiotici dovranno andare ad agire all’interno del corpo del malato. Una volta che un antibiotico attivato dal segnale luminoso ha esercitato il suo effetto, potrebbe essere disattivato con un diverso segnale luminoso.

Struttura di un antibiotico di Szymanski

Per rendere questi antibiotici on-off, Szymanski e collaboratori hanno modificato alcuni noti antibiotici inserendo nella loro molecola un gruppo azobenzenico, un gruppo fotosensibile a isomeria trans-cis. La luce ultravioletta converte l’azobenzene dalla sua forma trans alla forma cis. La luce blu può invertire il processo rapidamente. Altrimenti, l’azobenzene recupererà lentamente nel tempo la sua forma stabile, trans. L’isomerizzazione modifica la dimensione, la forma o la polarità complessiva della molecola, consentendole di colpire il microorganismo bersaglio.

Szymanski afferma che è sorprendente il numero di farmaci a cui basta aggiungere un gruppo fotocommutatore per conferir loro questa proprietà, esiste quindi la potenzialità per migliorarne la capacità di azione.

Glazer dice che un tale approccio è senza dubbio attraente ma osserva che ha alcune limitazioni. Una è la lunghezza d’onda della luce necessaria per eseguire la commutazione. Le migliori lunghezze d’onda per innescare l’isomerizzazione sono nella regione UV. La luce UV non è molto utile dal punto di vista medico, afferma Glazer, “poiché essa non penetra più di qualche millimetro nel tessuto e può inoltre indurre mutazioni del DNA nelle cellule sane”.

La luce rossa e infrarossa, d’altra parte, penetrano nel tessuto in profondità e in sicurezza. Stefan Hecht dell’Università Humboldt di Berlino sottolineava però che la luce rossa e infrarossa ha in genere i propri limiti. “Con la luce UV c’è molta energia che colpisce la molecola, ma se si irradia una molecola con luce rossa o quasi IR, la quantità di energia che scarichi nella molecola è minore piccola, e continuava: “fondamentalmente, quando la luce rossa o IR colpisce un gruppo foto-commutatore, lo fa con meno energia, e quindi l’isomerizzazione può essere meno probabile che con la luce UV. Ciò significa che il farmaco potrebbe essere meno potente. Sarebbe possibile superare alcuni di questi limiti e sintonizzare le molecole su lunghezze d’onda più lunghe concentrandosi sulla progettazione di interruttori migliori”, affermava Hecht.

Stefan Hecht

Alla fine dello scorso anno, Szymanski e collaboratori, fra i quali Ben Feringa[1], hanno fatto un passo avanti con gli antibiotici foto commutabili proprio nella direzione indicata da Hecht (M. Wegener et al. Photocontrol of Antibacterial Activity: Shifting from UV to Red Light Activation., J. Am. Chem. Soc., 2017, DOI: 10.1021/jacs.7b09281).

Essi hanno aggiunto alla molecola dell’antibiotico trimetoprim, azobenzeni in diverse posizioni sull’unità metossifenilica del farmaco per creare una libreria di molecole attivate da UV.

Nello screening su Escherichia coli, hanno trovato che una fra le molecole della libreria, è particolarmente potente quando attivata dalla luce UV. Per spostare la lunghezza d’onda a cui si verifica l’isomerizzazione trans-cis di questa molecola, il gruppo di Szymanski ha sostituito gli atomi sugli azobenzeni con fluoro e cloro. Una versione sostituita da cloro potrebbe essere isomerizzata da luce rossa. Non solo, ma quando questo trimetroprim fotoattivabile è stato attivato con luce rossa, risultò otto volte più potente contro E. coli rispetto a quando si interrompeva la luce. Per spegnere completamente il farmaco, i ricercatori hanno usato luce viola, che ha restituito rapidamente il farmaco alla sua forma originale, trans.

Fare farmaci antitumorali fotocommutabili “on”- “off” richiede un approccio diverso da quello per la progettazione di antimicrobici, afferma Oliver Thorn-Seshold della Ludwig Maximilian University di Monaco.

Oliver Thorn-Seshold

Con farmaci foto commutabili antitumorali selezionabili, i ricercatori devono infatti assicurarsi che i composti si leghino alle proteine bersaglio solo nella loro configurazione “on”. Legarli nella configurazione “off” significherebbe che i farmaci potrebbero danneggiare le cellule sane, anche esse contenenti quella proteina. Gli antibiotici fotocommutabili, d’altra parte, mirano a proteine specifiche dei batteri, non presenti nelle cellule umane sane. Sicchè essi non danneggiano le cellule sane qualsiasi sia la configurazione che assumono.

Thorn-Seshold fa parte del gruppo di ricerca e sviluppo CytoSwitch di Monaco, guidato da Yelena Wainman e sta progettando composti chiamati fotostatine, o PSTs (M. Borowiak et al. Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics. Optically Control Mitosis and Cell Death., Cell, 2015, DOI: 10.1016/j.cell.2015.06.049). Quando attivati ​​dalla luce blu, questi composti, basati sulla struttura del prodotto naturale combretastatina A-4, interferiscono con la replicazione delle cellule tumorali prendendo di mira elementi strutturali chiamati microtubuli.

Antitumorali di Thorn-Seshold e Dirk Trauner: colpiti da luce blu cambiano configurazione da trans a cis, in questa configurazione interferiscono con i microtubuli che regolano la replicazione delle cellule tumorali.

Le fotostatine di CytoSwitch (originariamente sviluppati da Thorn-Seshold e Dirk Trauner, ora alla New York University), sono completamente inattive prima di essere colpite dalla luce, dice Thorn-Seshold. Ciò significa che i medici potrebbero somministrare ai pazienti anche alte dosi di questi farmaci senza preoccuparsi degli effetti collaterali negativi. Alte dosi significano anche che si possono utilizzare lunghezze d’onda a bassa intensità e biocompatibili, perché anche se solo una piccola frazione del farmaco viene attivata, i livelli risultanti di molecole attive saranno sufficienti per il trattamento. Come altre molecole fotosensibili, dopo essere state inizialmente attivate con la luce, le fotostatine tornano alla loro forma originale, inattiva con una tipica emivita di 15 minuti, afferma Wainman.

Nello sviluppo delle fotostatine, Thorn-Seshold si sta imbattendo in un problema pratico estremamente importante per l’applicazione pratica: come fare arrivare la luce nella parte del corpo dove è necessario attivare o disattivare il farmaco. Ritiene che i diodi ad emissione di luce opportunamente impiantati potrebbero essere un’opzione praticabile. E’ infatti una tecnologia esistente, resa popolare da alcuni tatuatori che impiantano i LED sotto la pelle come espressione di una moda originale. I LED sono anche usati in studi di fisiologia optogenetica in modelli animali (topi).

Dirk Trauner

Trauner, uno dei pionieri della fotofarmacologia, non deve preoccuparsi tanto del problema della luce in almeno uno dei progetti cui sta lavorando, ripristinare la vista ai ciechi. Colpire gli occhi di un individuo con luce brillante non richiede alcuna procedura invasiva di impianto LED, sebbene possa essere necessaria una sorta di visiera protettiva.

Fra la miriade di composti fotocommutatori che Trauner sta studiando ve ne è uno che, acceso negli occhi di topi ciechi, sblocca un canale ionico e ripristina la sensibilità alla luce degli animali (A. Polouskina et al., Photochemical Restoration of Visual Responses in Blind Mice., Neuron 2012, 75, 271-282, DOI: 10.1016/j.neuron.2012.05. 022). Questi topi erano ciechi perché le i coni e i bastoncelli nei loro occhi non funzionavano più, il che accade anche nella degenerazione maculare umana.

Trauner è sicuro che questo lavoro di ripristino della visione diventerà clinicamente rilevante presto, o al massimo fra pochi anni. Dice che ora ha circa 120 esempi di molecole fotocommutabili che funzionano in colture cellulari o modelli animali. Alcuni di queste sono quasi allo stadio preclinico o clinico. E prevede che i suoi farmaci per il ripristino della vista saranno i primi farmaci fotofarmacologici approvati clinicamente.

Tuttavia, fare arrivare luce in aree del corpo umano diverse dagli occhi per periodi prolungati, come giorni o settimane nel caso di antibiotici, potrebbe presentare un problema significativo per la fotofarmacologia, afferma il chimico farmaceutico Dennis Liotta della Emory University (Atlanta), editor-in chief della rivista ACS Pharmaceutical Chemistry Letters. “Dal momento che la luce non può facilmente penetrare in profondità nella pelle degli adulti, bisogna superare la barriera tecnica di portare la luce sul luogo di azione”, dice, e prosegue: “Ci sono vari modi per farlo, ma per quanto ne so, tutti implicano l’uso di dispositivi sofisticati, e sono tutti impiegati in ambiente ospedaliero.”

Dennis Liotta

I punti più facili da raggiungere sono la pelle e gli occhi perché si può fare arrivare la luce direttamente su di essi. Per organi più difficili da raggiungere come il tratto gastrointestinale, i polmoni o la vescica, gli endoscopi potrebbero essere gli strumenti idonei. Per aree davvero difficili da raggiungere, tra cui il cervello e il midollo osseo, dovranno essere sviluppate nuove strategie.

Trauner concorda con Thorn-Seshold che a differenza dagli occhi, per molte di queste aree i LED impiantati potrebbero essere in definitiva il modo più utile per fornire luce.

Il settore dovrà affrontare anche possibili ostacoli normativi prima che questi farmaci fotocommutabili possano raggiungere la sperimentazione clinica. Szymanski afferma che ognuno di questi farmaci è in realtà costituito da due molecole – la versione “on” e la versione “off” – che devono essere sviluppate, testate per la sicurezza e la tossicità e sottoposte all’approvazione di un Organismo di Regolamentazione.

Hecht dice che i chimici farmaceutici con cui discute sono spesso scettici su quanto siano commerciabili medicinali foto commutabili. “Produrre una molecola di piccole dimensioni è già così complicato, l’introduzione del gruppo fotosensibile potrebbe aggiungere complicazioni che renderebbero più difficile il processo di approvazione.”

Liotta invece è più ottimista: “L’unico problema che vedo sono i profili tossicologici dei composti attivi e inattivi. Se sono entrambi sicuri, non dovrebbero esserci problemi intrinseci “.

Sia la Food and Drug Administration statunitense che l’Agenzia Europea per i Medicinali (EMA) non hanno ancora parlato di procedure normative per i farmaci fotocommutabili perché il settore è ancora agli inizi.

A causa di questo per ora vuoto normativo, Glazer sostiene che è importante concentrarsi sulla sperimentazione pre-clinica e clinica e assicurarsi che le molecole che i chimici stanno sviluppando possano condurre a trattamenti fattibili. Ciò è importante al fine che tempo e risorse non vengano spesi perseguendo idee anche teoricamente possibili, ma che in pratica sarebbe troppo macchinoso mettere in atto.

Abbiamo chiesto il parere di Vincenzo Balzani che volentieri di seguito riportiamo.

Si tratta di problemi noti; in linea di principio molto utili, ma, come al solito, bisogna vedere che risultati si ottengono. In questo campo la difficoltà maggiore, come qua e là accennato nel testo, è che i tessuti umani non sono trasparenti a luce visibile-UV, cioè di alta energia, che in genere è necessaria sia per fotosensibilizzare la formazione di ossigeno singoletto, sia per provocare reazioni di dissociazione di leganti o di fotoisomerizzazione. Altro problema è che la forma al buio e gli eventuali prodotti secondari della fotoreazione (qualcosa c’é sempre) non siano dannosi.

C’é molto da fare per cercare composti che siano attivabili  con infrarosso. Altrimenti si può usare eccitazione a due fotoni infrarossi, per avere l’energia necessaria a provocare  la fotoreazione. Si possono anche usare luce UV visibile  con guide ottiche se il tumore da distruggere è in una cavità del corpo (es. esofago). Alcune di queste cose sono descritte succintamente nel libro: V. Balzani, P. Ceroni, A. Juris, Photochemistry and Photophysics. Concepts, Research, Applications. Wiley, 2014, p. 370.

In conclusione, l’articolo è interessante, come una piccola review, anche se poco approfondito.

[1] Bernard Feringa, insieme a Jeanne-Pierre Sauvage e Fraser J. Stoddard, vincitori del Premio Nobel per la Chimica 2016 per la progettazione e la sintesi di macchine molecolari. Il comitato Nobel chimica si è però dimenticato che Vincenzo Balzani ha contribuito in modo fondamentale non solo alla realizzazione dei primi prototipi di macchine molecolari, in collaborazione con Fraser Stoddart e Jean-Pierre Sauvage, ma anche allo sviluppo e al consolidamento dei concetti alla base di questo campo di ricerca, divenuto negli anni uno dei settori più attivi e stimolanti della chimica moderna. Balzani e il suo gruppo posero le basi progettuali per la costruzione di macchine molecolari in un articolo del 1987. Anche il termine “molecular machine” venne pienamente discusso per la prima volta in un articolo firmato da Balzani, Stoddart e collaboratori nel 1993.

http://bologna.repubblica.it/cronaca/2016/10/12/news/chimica_il_nobel_mancato_l_appello_degli_scienziati-149629201/

*Katharine Sanderson- Photoswitchable drugs could light the way to more targeted treatments​

One thought on “Dalla terapia fotodinamica alla fotofarmacologia: le applicazioni mediche di una delle prime macchine molecolari

  1. Complimenti per l’articolo. molto esauriente e chiaro. L’ho letto con vivo piacere.
    Tra l’altro, settimana prossima mio padre – novantenne – si sottoporrà nuovamente (è il quarto ciclo in un decennio circa) alla terapia fotodinamica per cheratosi attinica al capo e al volto. Una terapia abbastanza pesante (per l’eritema “ustorio”) sia durante la somministrazione che per la prima settimana dopo l’applicazione, ma che dà ottimi risultati che durano almeno (o solo?) un paio d’anni.
    Grazie per l’impegno e ad maiora.

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