Batteri, chimica e altro (parte IV)

Nota: si ricorda che le opinioni espresse in questo blog non sono da ascrivere alla SCI o alla redazione ma al solo autore del testo.

a cura di Gianfranco Scorrano, già Presidente della SCI

la terza parte di questo post è stata pubblicata qui

Già Alexander Fleming aveva ricordato, nel suo discorso di accettazione del premio Nobel (AL E X A N D ER FL E M I N G ,Penicillin, Nobel Lecture, December 11,1945)

che:

But I would like to sound one note of warning. Penicillin is to all intents and purposes non-poisonous so there is no need to worry about giving an overdose and poisoning the patient. There may be a danger, though, in underdosage. It is not difficult to make microbes resistant to penicillin in the laboratory by exposing them to concentrations not sufficient to kill them, and the same thing has occasionally happened in the body.

The time may come when penicillin can be bought by anyone in the shops. Then there is the danger that the ignorant man may easily underdose himself and by exposing his microbes to non-lethal quantities of the drug make them resistant. Here is a hypothetical illustration. Mr. X. has a sore throat. He buys some penicillin and gives himself, not enough to kill the streptococci but enough to educate them to resist penicillin. He then infects his wife. Mrs. X gets pneumonia and is treated with penicillin. As the streptococci

are now resistant to penicillin the treatment fails. Mrs. X dies. Who is primarily responsible for Mrs. X’s death? Why Mr. X whose negligent use of penicillin changed the nature of the microbe. Moral: If you use penicillin, use enough.

Le previsioni di Fleming si sono puntualmente verificate. Avviene per esempio che se si usano quantità insufficienti di penicillina, i battteri siano in grado di produrre armi per affrontare l’intruso. Per esempio le beta-lattamasi (poliaminoacidi, con in particolare la serina) che sono capaci di idrolizzare il legame lattamico della penicillina che viene quindi aperto rendendo il farmaco non più attivo nell’attacco alle pareti cellulari dei batteri.

batteri41

Oltre all’attacco specifico sopra indicato esistono altri meccanismi per rendere gli antibiotici inefficaci: per esempio, i batteri possono modificare il punto di attacco dell’antibiotico sulla parete cellulare, rendendolo inefficace; oppure possono pompare fuori l’antibiotico (efflusso antibiotico) impedendogli così di avere tempo per agire sui batteri.

Finora la battaglia è stata condotta sintetizzando antibiotici sempre più sofisticati: tuttavia il problema si è sviluppato per ognuno di questi farmaci.

batteri42L’associazione World Health Association ha pubblicato nel 2014 una indagine mondiale sulla resistenza microbica ( batterica e virale) ai farmaci:

http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/112642/1/9789241564748_eng.pdf

Si tratta di una ricerca fatta mandando questionari a tutti i paesi del mondo, pubblicata nel 2014, con i dati riferiti al 2013 o prima. Hanno risposto 129 stati ad una o più delle nove domande rivolte; solo 22 paesi hanno completato interamente il questionario. E’ stata la prima volta che si svolgeva una indagine mondiale, il risultato è ottimo, sarà sicuramente migliorato.

Accanto a questa indagine abbiamo una indagine commissionata dalla Svezia, durante il semestre del 2009 quando aveva la presidenza della UE,

http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0011/120143/E94241.pdf

Una terza fonte di informazioni è nella rivista SciBX Science Business Exchange che in cooperazione con Nature ha dedicato un fascicolo a discutere di Antibiotic Resistance, con attenzione al mercato americano:

http://viewer.zmags.com/publication/e860b1bc#/e860b1bc/

Riassumo brevemente i tre lunghi documenti che volendo potrete consultare in rete.

Il problema della resistenza agli antibiotici è un grave problema:

Estimates of Burden of Antibacterial Resistance

European Union   population 500m

25,000 deaths per year    2.5m extra hospital days

Overall societal costs (€ 900 million, hosp. days)     Approx. €1.5 billion per year

United States  population 300m

>23,000 deaths     >2.0m illnesses

Overall societal costs Up to $20 billion direct Up to $35 billion indirect

Source: ECDC 2007     Source: US CDC 2013

 

Thailand   population 70m

>38,000 deaths    >3.2m hospital days

Overall societal costs US$ 84.6–202.8 mill. direct >US$1.3 billion indirect

Source: Pumart et al 2012

umano e anche economico come vedete dalle stime Europa, Usa e Tailandia.

Non solo grave, ma anche visto con preoccupazione perché, dopo uno sviluppo continuo dal 1969 al 1980, il numero di nuovi antibiotici registrati si è avvicinato a zero: per esempio negli USA nel periodo 2008-2012 sono stati approvati solo due antibiotici.

Da un lato le ditte farmaceutiche sono piuttosto riluttanti nell’ impegnarsi in attività di ricerca in un settore che promette pochi guadagni: i farmaci antibiotici vengono somministrati in cicli di cura di breve durata, hanno una concorrenza di molti prodotti, molti dei quali con brevetti scaduti e quindi che possono essere utilizzati come prodotti più economici (generici). Il risultato è che l’attesa di ritorno economico è più modesto per questo tipo di prodotti. Alcune stime dell’NPV (Net Present Value) pongono per gli antibiotici un valore di 100 che sale a 300 per un farmaco anti-cancro a 750 per uno neurologico e a 1150 per uno muscoloscheletrico. Naturalmente le speranze di innovazioni vengono poggiate su piccole aziende.

Sia in Europa che negli USA sono nati progetti per cercare incentivi per l’industria farmaceutica: negli USA la Generating Antibiotic Incentives Now (GAIN) un ente all’interno della Federal and Drug Administration con una legge che prevede esame preventivo rapido del farmaco così come sette anni di esclusività commerciale per prodotti per la cura di malattie infettive qualificate; e nella Comunità Europea all’interno della Innovative Medicines Initiative (finanziato metà dalla UE e metà dalle grandi industrie farmaceutiche) è entrato in funzione un piano chiamato New Drugs for Bad Bugs (ND4BB) per trovare sviluppi clinici per nuovi antibiotici e creare un consorzio dedicato alla ricerca di base sui patogeni Gram-negativi.

Forse non è un gran che ( in USA si sono avute nel 2014 tre registrazioni di farmaci antitumorali). Tuttavia, il problema è presente: la partecipazione italiana ai progetti europei su accennati vede quasi assenti le industrie farmaceutiche e purtoppo anche le università. E questo è grave.Di rilievo è anche lo sforzo di informazione per medici e pazienti del Ministero della Salute

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Batteri, chimica e altro (parte III)

Nota: si ricorda che le opinioni espresse in questo blog non sono da ascrivere alla SCI o alla redazione ma al solo autore del testo.

a cura di Gianfranco Scorrano, già Presidente della SCI

la seconda parte di questo post è stata pubblicata qui

Nella memoria popolare la scoperta di Fleming è quella che è rimasta più impressa anche se il contributo di Florey e Chain, assieme a quello di molti altri ricercatori, è quello che poi ha reso questi farmaci disponibili per combattere gravi malattie.

Dopo il premio Nobel del 1945, Chain si guardò intorno cercando una collocazione universitaria indipendente ma senza grande successo. Dall’estero ebbe offerte dal Weizman Institute in Israele e successivamente dall’Italia. Nel 1947 venne in Italia per un ciclo di conferenze (sotto gli auspici del British Council) e discusse a lungo con Domenico Marotta, Direttore dell’Istituto Superiore di Sanità (ISS). Marotta lo informò che nel 1945 l’Italia aveva accettato una offerta dell’UNRRA di un piccolo impianto di produzione di penicillina e $ 300.000 della Fondazione Rockfeller per la costruzione di un istituto. In risposta a una richiesta di consiglio Chain ritenne interamente non economicamente utile un’impianto così antiquato suggerendo che i fondi fossero utilizzati per costruire un centro di ricerca in microbiologia chimica con un annesso impianto pilota. Aggiunse che la mancanza in Europa di un centro di questo tipo aveva portato alla perdita degli antibiotici finiti nelle mani degli americani.

Chain rimase impressionato da Marotta ed accettò di venire a Roma nell’ottobre del 1948, per un anno. Prima di partire sposò Anne Beloff che poi lo seguì anche collaborando alle ricerche chimiche. Dopo due anni, rinunciò alla posizione a Oxford e rinnovò il contratto con l’Istituto Superiore di Sanità per ulteriori 10 anni, per dirigere il centro internazionale di ricerca per la microbiologia chimica dell’ISS.

Il centro di ricerca dell’ISS fu inaugurato nel giugno del 1951 alla presenza del Presidente del Consiglio Alcide De Gasperi e del Direttore Generale del WUO.

Nel periodo in cui Chain fu a Roma, instaurò un numero di contatti tra chimici inglesi e l’Italia, con visite anche sponsorizzate dal Bristish Council che furono di grande importanza per aprire la chimica italiana alle influenze inglesi. Ovviamente organizzò un gruppo di ricerca che produsse con lui dal 1959 al 1967: è interessante leggere i nomi dei collaboratori che furono poi particolarmente attivi nella chimica italiana. Tra essi voglio citare F.Arcamone e A.Ballio, quest’ultimo purtroppo da poco mancato.

La presenza di Chain fu segnalata anche attraverso l’attenzione della comunità scientifica che, tra l’altro, gli assegnò la Medaglia Marotta della Società Chimica Italiana, la nomina alla Accademia nazionale dei Lincei, la nomina alla Accademia dei XL e la laurea honoris causa all’Università di Torino.

Marotta andò in pensione, raggiunto il limite d’età, nel 1961.

Riprendendo in parte il racconto fatto da Paoloni (Giovanni Paoloni in Domenico Marotta in Il Contributo italiano alla storia del Pensiero: Scienze, ed-Treccani ), citato tra virgolette:

“Tra il 1963 e il 1964, in un complesso periodo di ridefinizione istituzionale del sistema della ricerca nella fase di avvio dell’alleanza di centrosinistra fra Partito socialista italiano e Democrazia cristiana, la comunità scientifica italiana fu scossa da una serie di indagini giudiziarie che evidenziavano l’inadeguatezza italiana in materia di politica e amministrazione della ricerca stessa. A farne le spese furono in primo luogo il Comitato nazionale per l’energia nucleare e l’ISS, due istituzioni nelle quali, per ragioni diverse, vi erano situazioni di conflittualità interna.”

“Nel caso dell’ISS, gli attriti erano legati soprattutto alle scelte del governo per la successione di Marotta. L’8 aprile 1964 l’ex direttore fu arrestato nell’ambito di un’indagine, originata dalle accuse di un impiegato amministrativo, in cui era imputato per peculato, falso ideologico e violazione di varie norme sulla contabilità di Stato.”

Nella stessa occasione fu indagato per corruzione e appropriazione indebita di fondi pubblici anche il successore di Marotta, il prof.Giacomello.

“Rimesso in libertà il 15 aprile, Marotta rifiutò di presentarsi in aula, dichiarando che una persona della sua età, che aveva reso importanti servigi al proprio Paese, non meritava di essere trattata in quel modo. Giudicato in contumacia, in primo grado fu condannato a sei anni e otto mesi di reclusione ( nota: e a una pena pecuniaria di 1,5 milioni di lire).”

Prigione e multa anche comminata, in misura minore, a Giacomello in particolare per aver amministrato un finanziamento a Chain del U.S.Department of Agricolture.

“ La comunità scientifica fu ampiamente solidale, in Italia e all’estero. L’Accademia dei XL respinse le dimissioni da presidente di Marotta subito presentate. Chain espresse giudizi molto critici sul procedimento, pubblicati dalla rivista «Science»”

Chain era accusato di avere venduto all’estero un brevetto di cui non era proprietario. Si offrì di venire a testimoniare a favore di Marotta, ma l’offerta non fu accettata. Inviò allora un telegramma al PM protestando vibratamente contro le accuse avanzate anche a lui. I documenti vennero passati al Tribunale di Velletri per accertare le eventuali offese alla magistratura romana. Il magistrato di Velletri nell’autunno del 1965 dichiarava di non aver trovato l’indirizzo di Chain (spostatosi a Londra) e nel febbraio del 1966 lo stava ancora cercando.

Altri dettagli si trovano in E.Abraham, Ernst B. Chain in Biographical Memoirs of Fellows of the Royal Society 29, 42-91 (1983).

“Nel giugno 1969 la sentenza d’appello escluse finalità di profitto personale nella condotta di Marotta, e ridusse la pena a due anni e undici mesi; nel 1971, infine, la Cassazione, pur confermando alcune imputazioni, dichiarò la condanna di Marotta estinta in seguito all’amnistia emanata nel 1966, per il ventennale della Repubblica.”

Nel 1957 fu pubblicata la sintesi chimica della penicillina da J.C.Sheehan,JACS, 79, 1262 (1957):

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1) NaOAc, EtOH, H2O, RT, 10 h, 24 %; 2) NH2NH2 Diossano , H2O, RT, 24 h, 82 %

3) Et3N, CH2Cl2, 0 °C, 22 h, 70 % 4) HCl,CH2Cl2,0-5 °C, 30 h, 94 % 5) DCC, NaOH,Diossano , H2O,RT, 33 h,

Da notare le molte invenzioni sintetiche fino all’uso della cicloesilcarbodiimide (DCC) per la formazione del legame ammidico (stadio 5) in assenza di acidi e basi.

E’ più conveniente effettuare una semisintesi, partendo dall’acido 6 – aminopenicillanico (6-APA, II da Cerruti http://www.minerva.unito.it/Storia/Penicillina/La%20penicillina.html ) costituito da due aminoacidi (cisteina e valina) fusi in un anello beta lattamico tiazolidinico. L’acilazione dell’azoto in 6 porta a vari derivati della penicillina (I)

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molti dei quali preparati con il metodo suddetto ed usati in medicina.

Dalle origini e finora, il ruolo dei chimici (Pasteur, Chain, Hogdkin e le centinaia di partecipanti al progetto penicillina) è stato assai rilevante. E’ curioso notare che, nella cultura da internet, le biografie di questi chimici sicuramente rilevanti e, a mio parere, benemeriti per l’umanità, non vengono citate, spesso, con la loro laurea formativa: in chimica.

La lotta per la salute dell’uomo continua e continuerà.

L’uso degli antibiotici si è sviluppato fortemente. Purtroppo, l’organismo batterico con il tempo è capace di identificate l’antibiotico e neutralizzarlo. Ma questo è un altro argomento che affronteremo nel prossimo post.

Batteri, chimica e altro (parte II)

Nota: si ricorda che le opinioni espresse in questo blog non sono da ascrivere alla SCI o alla redazione ma al solo autore del testo.

a cura di Gianfranco Scorrano, già Presidente della SCI

la prima parte di questo post è stata pubblicata qui

Il 3 settembre 1928, al ritorno dalle vacanze estive Fleming ritrovò il cumulo di capsule petri che aveva lasciato alla partenza: ma una di queste aveva un aspetto strano. Il fungo messo a reagire aveva distrutto tutta la parte circostante di stafilococci; stranamente, altri stafilococci più lontani apparivano non toccati. Fleming crebbe la muffa in una cultura pura e notò che produceva una sostanza che uccideva un vasto numero di batteri causa di varie malattie. Identificò la muffa come appartenente al genus Penicillium e dopo un po’ assegnò alla sostanza trovata il nome di penicillina (7 marzo 1929).

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Per molti anni, purtroppo non ci fu un grande interesse per questo ritrovato. Finchè Florey, dal 1936 direttore del Sir William Dunn School of Patology a Oxford non decise di costituire una squadra di ricercatori giovani ed abili e non assunse tra gli altri Ernest B.Chain. Dopo uno studio sul lisozima, Florey e Chain affrontarono il problema della penicillina: capirne la struttura, prepararne quantità robuste per una adeguata sperimentazione, magari sintetizzarla. Tutte imprese molto ragguardevoli.

Del gruppo ci interessa in particolare, per ragioni che vedremo tra poco, Chain, il terzo della foto che

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riunisce i primi tre (assegnatari del Premio Nobel per la Fisiologia o Medicina del 1945) da sinistra: Fleming, Florey, Chain con il collaboratore Hathley.

Nato nel 1906 a Berlino ove seguì gli studi per ottenere, seguendo il padre che era un chimico industriale, la laurea in chimica dalla Università Frederich-Wilhelm (Berlino) nel 1930. Dopo aver lavorato 3 anni nell’ospedale Charite Hospital di Berlino, nel 1933 emigrò in Inghilterra, dove sperimentò i problemi dell’esule con non molte risorse. Nel 1935 fu invitato alla università di Oxford e nell’anno successivo venne nominato dimostratore e lettore di patologia chimica nella Sir William Dunn Scool of Patology. Ma di cosa si interessò in maniera specifica? Qui ci viene in aiuto il sito del premio Nobel ( http://www.nobelprize.org/ ) dove oltre alle notizie biografiche dei vincitori, sono anche riportate le Nobel lectures presentate dai medesimi a Stoccolma. Quella di Chain, datata 20 marzo 1946, è intitolata :”The chemical structure of the penicillins” un lavoro certamente da chimico descritto in qualche dettaglio nelle 44 pagine del lavoro. Si apprende così che, come atteso, l’impresa aveva coinvolto, a Oxford, un gruppo di ricercatori inglesi piccolo all’inizio (Florey, Chain, Abraham, Baker (e il non citato Hathley), allargatosi successivamente ai chimici di altre università inglesi (Robinson, per esempio) e di aziende chimiche (Glaxo, Burroughs Wellcome, Imperial Chemical Industries) oltre a circa 200 ricercatori universitari e industriali degli Stati Uniti che hanno anche contribuito al lavoro di ricerca: Chain si qualifica come il rappresentante del gruppo iniziale.

Il lavoro presentato è un puro lavoro di chimica organica destinato a risolvere il problema della struttura della molecola penicillina: con le tecniche e le conoscenze, ovviamente disponibili ai tempi degli anni 1942-46. Ad esempio, per la penicillamina, un prodotto di degradazione della penicillina, vennero proposte due strutture (giusta la prima):

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La scelta sarebbe oggi semplicissima essendo sufficiente uno spettro NMR per differenziare le due strutture (il gruppo di-metilico nel primo composto appare come singoletto, mentre nel composto di destra il gruppo etilico terminale è un tripletto-quadrupletto sdoppiati dall’accoppiamento con il CH) . Siamo però negli anni 40, l’NMR non esiste ed allora bisogna tornare ai vari metodi chimici (la difficoltà di ossidare il gruppo gem-dimetilico della formula di sinistra) e provvedere poi alla sintesi del composto per verificarne la uguaglianza con quello ottenuto per decomposizione della penicillina (lo schema di sintesi è anche descritto).

Tutta la lettura della relazione di Chain è interessante e ci fa vedere un chimico in azione in questa impresa che si conclude con la polemica sulla struttura della penicillina correttamente proposta da Chain e Abraham benché avversata da Robinson e finalmente confermata della struttura con i raggi X da parte della chimica strutturista  Dorothy Crowfoot Hodgkin. Nata nel 1910 al Cairo, a 18 anni cominciò gli studi in chimica all’Università di Oxford, proseguì con il PhD a Cambridge ritornò poi a Oxford dove nel 1936 fu nominata fellow e tutor in chimica posizioni che tenne fino al 1977. Strutturista, usò i raggi X per definire la struttura di: uno steroide (colesteril ioduro,1945) penicillina (1945, pubblicata nel 1949), vitamina B12 (1955) insulina (cominciata nel 1934, definita nel 1969). Nel 1964 le fu attribuito il premio Nobel per la chimica.

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Dorothy Crowfoot Hodgkin

Dunque la struttura della penicillina è quella di un beta lattame, mai prima trovata per un composto naturale ma che è la struttura poi capace di legarsi alla superficie dei batteri, aprendo l’anello a 4 atomi, e distruggere così le cellule batteriche.

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La penicillina entrò subito nell’uso ospedaliero per la protezione delle infezioni e servì a salvare innumerevoli vite umane; entrò anche, come capostipite dei farmaci antibiotici, nella fantasia popolare tanto che il servizio farmaceutico nazionale si è recentemente premurato di raccomandare l’uso degli antibiotici solo quando necessari, senza abusi che possono poi favorire l’insorgere nei batteri di β-lattamasi, cioè enzimi che catalizzano l’idrolisi dell’anello lattamico e quindi la distruzione dell’antibiotico.

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