Nuova tecnica per immagini diagnostiche

Rinaldo Cervellati

I microscopi ottici (light microscopes) oggi sono così potenti che possono ottenere una risoluzione nanometrica in una cellula attiva, usando coloranti fluorescenti. I ricercatori vorrebbero essere in grado di controllare la fluorescenza al fine di illuminare selettivamente e seguire nel tempo molecole specifiche nelle cellule viventi. Ma questa impresa non è facile perché i coloranti fotoattivabili comunemente usati per individuare le molecole hanno alcuni limiti: molti di essi sono voluminosi, quindi non possono identificare molecole più piccole con adeguata risoluzione se non attivati ​​con luce laser ad alta energia. Tuttavia un’intensa illuminazione danneggia il DNA e i mitocondri e provoca legami incrociati nelle proteine. Inoltre offusca la fluorescenza provocata nei coloranti. Pertanto scoprire coloranti che possono essere attivati ​​con luce visibile a bassa potenza sarebbe grande un vantaggio per l’immagine diagnostica nei campioni istologici di tessuti viventi.

Un gruppo di ricercatori del Texas ha recentemente sviluppato una tecnica per indurre fluorescenza anche multicolore in noti coloranti attivandola ​​con luce visibile. Il metodo prevede la commutazione di un atomo di ossigeno in un colorante fluorescente con un atomo di zolfo, che lo rende non fluorescente e viceversa, attraverso l’alternanza di luce e buio in presenza e in assenza di ossigeno. Questo nuovo approccio permette di visualizzare come proteine ​​e altre molecole si comportano nelle cellule viventi senza danneggiare il tessuto (Juan Tang et al., Single-Atom Fluorescence Switch: A General Approach toward Visible-Light-Activated Dyes for Biological Imaging., J. Am. Chem. Soc. 2019, DOI: 10.1021/jacs.9b06237).

La notizia è stata riportata da Alla Katsnelson nel numero del 30 settembre scorso di Chemical & Engineering news (Single-atom switcheroo yields fluorescent dyes activated by visible light).

In precedenza era stato riportato che la sostituzione di un gruppo carbonilico con un gruppo tiocarbonilico in un colorante può estinguerne la fluorescenza. Nel nuovo studio, Han Xiao, chimico e bioingegnere della Rice University, responsabile della ricerca, e il suo team hanno dimostrato che se il gruppo tiocarbonilico viene incorporato nel sistema coniugato di un normale colorante fluorescente sopprimendone la fotoattività, il colorante può essere ri-foto ossidato con luce visibile.

Han Xiao,Xiao e il suo team hanno utilizzato una reazione chimica che ha coinvolto il reagente di Lawesson[1], noto agente tionante per trasformare l’ossigeno del gruppo carbonile di un normale colorante in zolfo, essenzialmente sopprimendo la fluorescenza.

La fluorescenza può essere alternatamente indotta e spenta tramite il lampeggiamento della miscela con luce visibile a bassa intensità di lunghezza d’onda uguale o più corta di quella emessa dal colorante, come mostrato nello schema seguente:

Se il colorante è rosso, come nello schema[2], una luce rossa, verde o blu lo attiverebbe.

“La chimica che stiamo usando è davvero semplice”, dice Xiao. La fotoattivazione richiede solo luce visibile e ossigeno, presenti a livelli sufficienti nella miscela tamponata all’adeguato pH.

Il gruppo di Xiao ha utilizzato l’approccio per creare versioni attivate dalla luce di comuni coloranti rosso, verde, blu e viola che vengono utilizzati per visualizzare diverse biomolecole o parti della cellula. Hanno usato uno dei coloranti per marcare le parti lipidiche e un altro per contrassegnare siti specifici all’interno di una proteina.

Un colorante rosso fotoattivato (in basso a sinistra) visualizza le goccioline lipidiche in una cellula proprio come un colorante verde non fotoattivabile commerciale (in alto a destra). Il colore marrone mostra la colocalizzazione dei coloranti (in basso a destra). I nuclei cellulari sono colorati di blu.I ricercatori del gruppo hanno anche dimostrato che si possono usare due coloranti diversi contemporaneamente per marcare diverse parti di una goccia lipidica.

Luke D. Lavis, biochimico del Janelia Research Campus, afferma che la ricerca è convincente perché l’estinzione della fluorescenza viene effettuata con la sostituzione di un singolo atomo, quindi le dimensioni della molecola non vengono praticamente alterate.

Esiste una grande varietà di coloranti non fotoattivabili e la maggior parte di essi dovrebbe rispondere a questa strategia, afferma Xiao. “La bellezza della nostra chimica è che non ha bisogno di una fonte di luce davvero forte. Puoi usare un LED che ottieni da Amazon e funziona.”.

Il gruppo di Xiao sta continuando a studiare altri coloranti con questo approccio. Stanno anche testando la tecnica con coloranti fluorescenti nel vicino infrarosso, che possono penetrare più profondamente nei tessuti.

Bibliografia

[1] J.M. Goldberg et al., Minimalist Probes for Studying Protein Dynamics: Thioamide Quenching of Selectively Excitable Fluorescent Amino Acids., J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 14, 6088-6091.

[1] Il reagente di Lawesson, o LR (2,4-Bis (4-metossifenil)-1,3,2,4-dithiadiphosphetane-2,4-disolfuro), è un composto chimico molto usato in sintesi organica come agente tionante.

[2] Si tratta di rosso del Nilo (noto anche come ossazone blu del Nilo), 9-diethylamino-5-benzo[a]phenoxazinone, una sostanza lipofila.